Proteināzes K īpašības, fermentatīvā aktivitāte un pielietojumi



The proteāzes K ir enzīms, kas pieder serīna proteāžu grupai, tas ir, tā aktīvajam katalītiskajam centram ir aminoskābju serīns, un tam ir funkcija, lai likvidētu peptīdu saites ar hidrolīzi. Savukārt šis enzīms pieder pie proteīnu subtilizīnu (peptidāzes S8) \ t.

Proteināzes K molekulmasa (MW) ir 28 900 daltonu un pirmo reizi tika izdalīta 1974. gadā no sēnītes ekstraktiem. Engyodontium albums, iepriekš pazīstams ar nosaukumu. \ t Tritirachium albums Limber.

Tam piemīt augsta proteolītiskā spēja, kas pierāda, ka spēj noārdīt matos esošo keratīnu. Vārds keratīns angļu valodā ir rakstīts "keratīns", tāpēc to sauc par "proteināzi K".

Pateicoties tā lielajai spējai šķērsot dabīgos proteīnus, šis enzīms ir noderīgs dažādās molekulārās bioloģijas metodēs. To galvenokārt izmanto, lai izolētu un sagatavotu nukleīnskābes ar augstu molekulmasu (MW)..

Proteināzes K iedarbojas, atbrīvojot kodolvielas DNS, vienlaikus iznīcinot proteīnus un inaktivējot RNāzes un DNāzes, tas ir, novērš nukleīnus DNS un RNS preparātos..

No otras puses, ir redzams, ka proteāze K var hidrolizēt dažus denaturētus vietējos proteīnus, kas izraisījuši pētnieku interesi par tā izmantošanu prionu proteīnu (PrPC) pētījumā..

Tomēr, neskatoties uz tā augsto potences pastāv proteolītiskiem olbaltumvielas, kas ir izturīgas pret rīcībai proteināzi K. starp tiem, daži neparasti olbaltumvielas sauc prioni (PrPSc), kas saistīta ar TSE ir.

Indekss

  • 1 Proteīna K raksturojums
  • 2 Enzīmu aktivitāte
  • 3 Pieteikumi
  • 4 Proteīna K priekšrocības
  • 5 Proteināzes rezistenti proteīni K
  • 6 Atsauces

Proteīna K raksturojums

Proteināzei K ir terciārā struktūra, ko veido trīs slāņi ar septiņu ķēžu β loksni starp diviem heliksu slāņiem. Tā kā tā pieder S8 peptidāžu ģimenei, tai raksturīga katalītiskā triāde aktīvajā vietā, kuras secīgā secība ir (Asp, His un Ser), kas tos atšķir no citām peptidāžu ģimenēm..

Šis enzīms no serīna proteāžu grupas ir raksturīgs, hidrolizējot peptīdu saites ar alifātisko un aromātisko aminoskābju karboksilgrupu..

No otras puses, tā spēj darboties noteiktu kodīgu vielu, piemēram, nātrija dodecilsulfāta (SDS), Tris-HCL un EDTA klātbūtnē, ko izmanto, lai palīdzētu proteīnu denaturācijai, izraisot to zaudēt savu dabisko struktūru..

Tas ir sākotnējais solis proteīnu sagatavošanā elektroforēzes metodei. PH diapazons, kurā proteāzes K iedarbojas diezgan plaši (2,0 līdz 12,0), ar optimālo pH starp 7,5 un 12,0, un tā izoelektriskais punkts ir 8.9. Kā redzams, tas ir aktīvs pret ļoti plašu pH diapazonu.

Vēl viena iezīme, kas izceļas ar proteīnu K, ir tās stabilitāte augstās temperatūrās (50 - 60 ° C)..

Enzīmu aktivitāte

Proteīnazei K ir nepieciešama kalcija jonu klātbūtne, lai gan tas neietekmē tā aktivitāti, ja ir būtiski saglabāt tā stabilitāti.

Lai proteāze K veiktu pilnīgu substrāta sagremošanu, ir nepieciešams aptuveni 5 minūtes līdz 2 stundas..

Tomēr šajā ziņā Daza et al. Salīdzinot DNS, kas iegūts vairākkārtīgi iedarbojoties uz proteināzi K, tīrību un secināja, ka ilgstoša inkubācija (līdz 24 h) ievērojami uzlabo DNS kvalitāti..

Tagad attiecībā uz koncentrāciju, ko dažādos protokolos izmanto proteīna K enzīms, var teikt, ka tas ir ļoti atšķirīgs.

To var izmantot no ļoti zemām koncentrācijām (5 μg / ml) līdz koncentrācijām 500 μg / ml. Bet visbiežākās darba koncentrācijas svārstās no 50 līdz 100 μg / ml, īpaši proteīnu gremošanas un nuklāzes inaktivācijas gadījumā. Lai gan audu ārstēšanai nepieciešama koncentrācija 2 mg / ml.

Programmas

Tās pieteikumi ir ļoti plaši, un tos var apkopot šādi:

-Tas tiek izmantots, iztvaicējot olbaltumvielu un DNS iegūšanas metodes kā ir vairāki: sālīšanu-out, PK-SDS, cetiltrimetilamonija bromīdu amonija bromīds (CTAB), un kālija acetāts pārveidots, ekstrahējot ar nātrija jodīda.

-Nukleāzes (RNāzes un DNāzes) inaktivācija.

-Hibridizācijas metodē in situ (HIS), lai palīdzētu atbrīvot nukleīnskābi, papildus novēršot nevēlamus proteīnus.

-Olbaltumvielu modifikācija.

-Pētniecības līmenī, dažādos pētījumos.

Proteīna K priekšrocības

Ir veikti vairāki salīdzinošie pētījumi starp DNS ekstrakcijas metodēm, izmantojot proteīnu K, ar citiem, kas to neizmanto, un visi secina, ka, lietojot fermentu, ir lielāks ieguvums. Starp priekšrocībām var minēt:

-Iegūst augstas kvalitātes augstas kvalitātes DNS un tīrības DNS.

-Ekstrahētā DNS ir stabila līdz 3 mēnešiem.

Ekstrahēto DNS var izmantot šādos paņēmienos: Southern blot, polimerāzes ķēdes reakcija (PCR), elektroforēze, cita starpā.

Proteīni, kas ir rezistenti pret proteīnu K

Dažādi pētījumi ir secinājuši, ka prioni (patoloģiskas PrPSc toksiskas olbaltumvielas) atšķiras no PrPC proteīniem (native), jo tie ir rezistenti pret proteāzes K iedarbību, savukārt PrPC ir jutīgi pret to iedarbību..

Citi autori ir aprakstījuši, ka PrPSc struktūrā ir jutīgas porcijas un citi, kas ir izturīgi pret proteīnu K. Tomēr abas daļas ir vienlīdz toksiskas un infekciozas..

No otras puses, 1987. gadā Bastian un līdzstrādnieki izolēja 4 olbaltumvielas no 28, 30, 66 un 76 kda \ t Spiroplasma mirum. Visi bija izturīgi pret proteāzes K iedarbību, un tiem bija arī krusteniska reakcija ar dažiem prioniem.

Ir zināms, ka šī suga var radīt kataraktu un būtisku neiroloģisku bojājumu, un sakarā ar zinātniskajiem atklājumiem Bastians, starp citiem pētījumiem, ir mēģinājis saistīt ar šo mikroorganismu ar transmisīvo sūkļveida encefalopātiju.

Tomēr šīs deģeneratīvās neiroloģiskās patoloģijas etioloģija joprojām ir saistīta ar prioniem šodien.

Šajā ziņā Butler un līdzstrādnieki 1991. gadā identificēja un raksturoja 40 Kda proteīna rezistentu proteīna K klasi no diviem celmiem. Mycoplasma hyorhinis. Šis patogēns ietekmē cūkas, kas inficē savus audus, bet šajā gadījumā krusteniska reakcija ar pārbaudītajiem prioniem nebija.

Ir nepieciešami vairāki pētījumi, lai noskaidrotu daudzus nezināmus.

Atsauces

  1. Bastian F, Jennings R, un Gardner W. 1987. Antiserums skrepi saistītā fibrila olbaltumvielai krusteniski reaģē ar Spiroplasma mirum fibrila olbaltumvielas. J. Clin. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. DNS ekstrakcijas un attīrīšanas metodes novērtējums no muskuļu audiem, kas fiksēti formaldehīdā no neidentificētiem cadavers.  Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, un Mcgarrity G. Proteināzes K rezistentu proteīnu identifikācija un raksturojums Mollicute klases locekļos. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Divu protokolu salīdzinājums DNS iegūšanai no Trypanosoma cruzi audzēti akeniskā vidē. Peru. Med. Exp. Sabiedrības veselība  2014; 31 (2): 222-227. Pieejams: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E un Palma W. Piecu DNS ekstrakcijas protokolu efektivitātes noteikšana no parafīna materiāla molekulārajos pētījumos. Rev Méd Univ Kostarika. 2007. gads; 1 (1): 10-19.