DNS sekvencēšana Maxam-Gilbert, Sanger metode, piemēri



The DNS sekvencēšana (dezoksiribonukleīnskābe) ir procedūra, ko veic molekulārās bioloģijas laboratorijās, kas ļauj zināt nukleotīdu secību interesējošajā ģenētiskajā materiālā. Turklāt var atklāt arī RNS (ribonukleīnskābes) secību.

Šī metode ir bijusi nepieciešama bioloģisko zinātņu attīstībai. Tas ir piemērojams arī citām zināšanām - piemēram, medicīniskajai diagnozei un kriminālistikas izmeklēšanai.

Iepriekš DNS virknes sekvencēšana tika uzskatīta par lēnu un dārgu aktivitāti, kas ļāva identificēt tikai dažus bāzes pārus oligonukleotīdos..

Mūsdienās ar visiem zinātnes sasniegumiem DNS sekvencēšana ir ikdienas darbība daudzās laboratorijās visā pasaulē, pateicoties gandrīz 50 gadu pētniecībai šajā jomā. Kas attiecas uz ķēdes garumu, ļoti īsā laikā var secināt līdz miljoniem bāzes pāru.

Lai to izdarītu, ir izstrādāti vairāki tehniskie paņēmieni, kas atšķiras pēc cenas un precizitātes. Šajā rakstā mēs aprakstīsim gan klasiskās, gan modernās tehnikas, katra ar savām priekšrocībām un trūkumiem.

Līdz šim sekvencēšanas paņēmieni ļauj iegūt pilnīgu genomu secību, sākot no mazām prokariotēm un raugiem līdz cilvēka genomam.

Indekss

  • 1 DNS struktūra
  • 2 Vēsture
  • 3 Sanger metode
    • 3.1. Reakcijas galvenās sastāvdaļas
    • 3.2 Rezultātu lasīšana
  • 4 Automātiska secība
  • 5 Maxam-Gilbert secība
    • 5.1 Procedūra
    • 5.2 Rezultātu lasīšana
  • 6 Masveida sekvencēšana
    • 6.1
    • 6.2 Sekvencēšana pēc sintēzes
    • 6.3 Sekvences noteikšana, izmantojot piesaisti
    • 6.4 Ion Torrent secība
  • 7 Piemēri
    • 7.1. Cilvēka genoma sekvencēšana
  • 8 Nozīme un lietojumi
  • 9 Atsauces

DNS struktūra

Lai izprastu DNS sekvencēšanai izmantotās metodes un paņēmienus, ir jāzina daži molekulas struktūras un sastāva galvenie aspekti.

DNS ir biomolekula, kas atrodama visās dzīvās būtnēs, sākot no baktērijām līdz lieliem ūdensdzīvniekiem. Organelēm - piemēram, mitohondrijām un hloroplastiem - ir iekšpusē cirkulāra DNS molekula. Pat dažos vīrusos atrastais ģenētiskais materiāls ir DNS.

Strukturāli DNS ir nukleotīdu kopums. Katrs no tiem ir integrēts ar ogļhidrātu, slāpekļa bāzi (A, T, C vai G) un fosfātu grupu. DNS sekvencēšanas mērķis ir atklāt secību, kādā četras slāpekļa bāzes atrodas secībā.

Vēsture

1950. gadu vidū pētnieki Watson un Crick aprakstīja DNS struktūru, izmantojot kristoloģiskās metodes. Tomēr neviens no šiem pētniekiem nevarēja atrast veidu, kā atklāt secību.

Lai gan bija daži priekšgājēji, vissvarīgākais notikums bija Sanger metodes radīšana 1977. gadā. Metodes tēvs Frederiks Sangers bija britu bioķīmiķis, divu Nobela prēmiju ieguvējs par milzīgajiem ieguldījumiem bioloģijas zinātnē.

Šī metode literatūrā ir pazīstama arī kā "ķēdes izbeigšana" vai dideoksinukleotīdi. Tālāk mēs aprakstīsim šīs metodes principus un tos, kas izstrādāti, balstoties uz uzlabojumiem un jauninājumiem.

Sanger metode

Sangeras metodes attīstība bija būtisks notikums molekulārajā bioloģijā. Tas ietver DNS replikācijas procesa pamatkomponentus, kas parasti notiek šūnā, bet pievienojot īpašu komponentu: dideoksinukleotīdus.

Reakcijas galvenās sastāvdaļas

- DNS polimerāze: fermenta DNS polimerāze ir būtisks procesa elements. Šī molekula piedalās DNS virknes replikācijā un tās loma ir jaunās ķēdes sintēze, kas atbilst dezoksiribonukleotīdu trifosfātam ar komplementārajiem..

Atcerieties, ka DNS gadījumā timīni (T) ir savienoti ar adenīniem (A), izmantojot divas ūdeņraža saites, bet citozīns (C) ar guanīnu (G) - ar trim tiltiem.

- Nukleotīdi: Sanger sekvencēšana ietver divu veidu nukleotīdus, četrus 2'-dezoksinukleotīdus (saīsināti kā dATP, dGTP, dCTP un dTTP) un četrus dideoksinukleotīdus (ddATP, ddGTP, ddCTP un ddTTP).

Lai gan dideoksinukleotīdi ir līdzīgi monomēriem, kas parasti tiek iekļauti DNS, viņiem trūkst -OH grupas. Tas padara neiespējamu ķēdei pievienot jaunu nukleotīdu.

Tāpēc, kad pievieno īpašu nukleotīdu - pilnīgi nejaušā veidā - veidošanās ķēdē, sintēze ir paralizēta. Tādā veidā reakcijas beigās ir dažādu izmēru ķēdes, katra no tām, kur reakcija tika pārtraukta citā vietā.

Eksperimentāli tiek sagatavoti četri izmēģinājumi. Katrs satur DNS, kas iegūts no interesējošā bioloģiskā parauga, parastie nukleotīdi un viens no četriem īpašo nukleotīdu veidiem. Vai īpašie nukleotīdi ir atzīmēti ar kāda veida fluorescējošu marķieri (skatīt zemāk automatizēto secību).

Rezultātu lasīšana

Pirmais solis ir atdalīt katru sintezēto ķēdi atkarībā no to lieluma. Daži būs garāki nekā citi, atkarībā no tā, kur tika iekļautas speciālās bāzes.

Ir dažādas bioķīmiskās metodes, kas ļauj nošķirt maisījuma sastāvdaļas, izmantojot lielumu kā diskriminējošu īpašību. Sanger metodē dažādas ķēdes tiek atdalītas ar elektroforēzi. Vismodernākajos tehnikas variantos tiek izmantota kapilārā elektroforēze.

Tādējādi garākās virzieni pārvietojas mazāk nekā īsāki varianti. Tad šī sistēma iet caur lasītāju, kas atpazīst marķieri, kas iekļauts katrā dideoksinukleotīdā. Tādā veidā var uzzināt secības secību.

Šī "pirmās paaudzes" tehnika spēj nolasīt ne vairāk kā 1 kilobāzes DNS fragmentus. Šobrīd Sanger metodi izmanto vairākās laboratorijās, parasti tās modernajos variantos. Turklāt to izmanto, lai apstiprinātu rezultātus, kas iegūti ar visbiežāk sastopamām metodēm - bet ne tik precīzu.

Automātiska secība

Ja ir nepieciešama liela mēroga secība, procesu paātrina automatizācija. Tas ir Sanger ķēdes izbeigšanas metodes variants, kur gruntis ir marķēts ar fluorescējošiem produktiem, lai tos atšķirt.

Pēc tam reakcijas produkts tiek darbināts ar elektroforēzi - viss vienā joslā. Kad katrs fragments atstāj gēla galīgo daļu, to ātri identificē ar fluorescējošo marķējumu, ar kļūdu, kas ieskauj 1%..

Vispilnīgākajām sistēmām ir sistēma ar līdz pat 96 kapilāru caurulēm, ko darbina ar robotu savienots dators. Tas nozīmē, ka vienlaicīgi var novērtēt 96 DNS paraugus. Tādējādi process, kas ietver elektroforēzi un rezultātu analīzi, ir pilnībā automatizēts.

Vienā dienā šīs sistēmas var sekot līdz pat 550 000 bāzēm. Procesa laikā cilvēka darbs nav nepieciešams, lai sāktu metodi tikai 15 minūtes.

Sekošana pēc Maxam-Gilbert

Tajā pašā laikā, kad Sanger publicēja savu darbu, diviem pētniekiem, kas nosaukti Allan Maxan un Walter Gilbert, izdevās izstrādāt citu metodi DNS sekvences iegūšanai. Metode ieguva popularitāti tajā laikā, bet vēlāk to nomainīja, uzlabojot Sanger metodi.

Pretēji Sanger metodei Maxan un Gilbert secība (vai ķīmiskā secība, kā zināms arī) neietver hibridizācijas reakcijas. Metodoloģija sastāv no marķēšanas ar reaktīviem līdzekļiem vienā galā, kam seko attīrīšanas process.

Viens no šīs tehnikas negatīvajiem aspektiem ir tā milzīgā sarežģītība un lietošanai bīstamu ķīmisku vielu izmantošana. Ķīmiskos bojājumus izraisa DMS, skudrskābes, hidrazīna un hidrazīna izmantošana ar sāļiem.

Procedūra

Protokols sākas ar marķējumu šķiedras 5 'galā ar fosfora marķieri 32, tad notiek slāpekļa bāzes ķīmiskā modifikācija un tā ir atdalīta. Visbeidzot, notiek sadrumstalotā reģiona sadalīšana.

Pirmkārt, secīgā ķēde tiek saīsināta mazākos segmentos. Šis solis tiek veikts ar restrikcijas enzīmiem, kas rada izcilas galējības.

Pēc tam reakcija tiek veikta ar sārmainu fosfatāzi, kuras mērķis ir novērst fosfātu grupu. Tādējādi, lai veiktu marķēšanu, var izmantot polinukleotīdu kināzi.

Ķēde ir denaturēta (divas atveres). Tad mēs turpinām ķimikālijas. Šīs šķelšanās reakcijas tiek veiktas kontrolētā veidā un kāda veida ķimikālijas tiek sadalītas, izmantojot katru ķīmisko vielu.

Rezultātu lasīšana

Tāpat kā Sangeras metodē, rezultātu nolasīšana ietver elektroforēzes sistēmā iegūto ķēžu lieluma atdalīšanu. Sistēmas, kas sastāv no poliakrilamīda, ļauj iegūt ļoti atbilstošu izšķirtspēju gēla nolasīšanai.

Masveida sekvencēšana

Masveida sekvencēšana ietver virkni jaunu metožu, kas saīsinātas kā NGS, no angļu valodas.Nākamās paaudzes secība ".

Metodes, kas katalogētas kā NGS, prasa iepriekšējo DNS amplifikācijas soli (tās nedarbojas ar vienu molekulu). Turklāt izmantotās platformas ir ļoti atšķirīgas. Vispopulārāko metožu principi tiks aprakstīti turpmāk:

Pyrosequencing

Tas ietver pirofosfāta izdalīšanās uzraudzību, kas notiek katru reizi, kad tiek pievienots jauns DNS nukleotīds. Enzīmu sistēma ir savienota, lai gaismas emisija (kas ir konstatējama ar kameru) notiek katru reizi, kad tiek pievienots jauns nukleotīds..

Process sākas ar katras slāpekļa bāzes atsevišķu inkubāciju, lai pārbaudītu, vai ir gaismas emisija. Pyrosequencing var veikt garo virzienu nolasīšanu, bet atrastais kļūdu līmenis ir augsts.

Sekvencēšana pēc sintēzes

Tas ietver iezīmētu nukleotīdu iekļaušanu. Šīs fluorescējošās sastāvdaļas tiek pievienotas, nomazgātas un iekļauts iekļautais nukleotīds. Pēc tam tiek atcelts nukleotīdu marķējums, un turpina turpināt stresa sintēzi. Nākamajā posmā tiks iekļauts arī marķēts nukleotīds, un minētie soļi tiks atkārtoti.

Viens no šīs metodes trūkumiem rodas, ja fluorescējošie marķieri nav pilnībā izvadīti. Šīs emisijas rada fona kļūdas, radot būtiskas kļūdas.

Sekvencēšana pēc ligēšanas

Šī metode atšķiras no citiem, jo ​​tā neizmanto DNS polimerāzi. Tā vietā šīs metodikas galvenais enzīms ir ligāze. Šeit tiek izmantoti fluorescenti iezīmēti DNS fragmenti, kas saistīti ar fermentu un tiek atklāti.

Lielākā problēma ar šo tehniku ​​ir ļoti īss fragmenta garums, kas spēj apstrādāt.

Jonu secības Torrent

Šī metode ir balstīta uz H jonu mērījumiem+ kas tiek izlaists katru reizi, kad tiek pievienots jauns nukleotīds. Princips ir gluži līdzīgs pirozekvences noteikšanai, bet daudz lētāk.

Piemēri

Cilvēka genoma sekvencēšana

Cilvēku genoma secība ir bijusi viens no daudzsološākajiem izaicinājumiem bioloģijā, kā arī viens no atzinīgākajiem konkursiem zinātnes vēsturē. Faktiski projektā iesaistītajiem zinātniekiem genoma sekvencēšana kļuva par konkursu.

1990. gadā viņš sāka to, ko dēvē par "cilvēka genoma projektu", ko vadīja slavenais zinātnieks, Nobela prēmijas uzvarētājs Džeimss Vatsons. Pēc viena gada, 1991.gadā, Venter uzņemas izaicinājumu „pārspēt” Vatsonu un sekot līdzi genomam. Tomēr 1992. gadā Watsons aizgāja pensijā un komandu pieņēma cits pētnieks.

1995.gadā Venter paziņoja par panākumiem bakteriālā genoma pilnā secībā pēc nejaušības secības noteikšanas metodes. Līdzīgi, pretējā komanda pēc gada paziņoja rauga genoma secību.

2000. gadā sacensības tika pārtrauktas. Abi uzņēmumi publicēja savus pilnīgā genoma provizoriskos rezultātus divos prestižākajos zinātnes žurnālos: Daba un Zinātne.

Tomēr zinātnieki turpināja strādāt pie priekšlikumu uzlabošanas, un 2006. gadā sekvences tika pabeigtas ar zināmām cilvēka hromosomām.

Nozīme un lietojumi

Zinot molekulas tikpat svarīgu kā nukleotīdu secību, DNS ir vērtīgs bioloģiem un saistītiem speciālistiem. Šī polinukleotīdu ķēde satur visu informāciju, kas nepieciešama visu dzīvības formu attīstībai un uzturēšanai.

Šo iemeslu dēļ zināšanas par šo secību ir būtiskas bioloģiskajiem pētījumiem. Būtībā secība ļauj izmērīt vienu no svarīgākajām bioloģisko sistēmu īpašībām un noteikt atšķirības starp tām.

Sekvencēšanu plaši izmanto taksonomisti un sistematisti, jo dažas DNS sekvences ļauj noteikt kritērijus, lai secinātu, vai divi organismi pieder vienai sugai vai nē, kā arī spēj piedāvāt hipotēzes par to filogenetiskajām attiecībām..

Turklāt DNS sekvencēšanai ir pielietojumi medicīnas un diagnostikas jomā. Piemēram, ir pieejamas un pieejamas sistēmas, kas, izmantojot secību, ļauj novērtēt tendenci attīstīt noteiktas slimības (piemēram, vēzi), izmantojot tā sauktos vienkāršos nukleotīdu polimorfismus (SNP)..

Kriminālistikas un kriminālistikas izmeklējumi ir bagātināti arī ar sekvences metodēm, un tos var izmantot kā ticamus pierādījumus par konkrētas personas līdzdalību noziegumā.

Atsauces

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Sekvenču secība: DNS sekvencēšanas vēsture. Genomika, 107(1), 1-8.
  2. Koboldts, D.C., Steinbergs, K.M., Larsons, D.E., Vilsons, R.K., & Mardis, E.R. Nākamās paaudzes secības revolūcija un tās ietekme uz genomiku. Šūna, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Zinātniskās sacensības. No Galileo līdz cilvēka genoma projektam. Paraninfo Redakcija.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNS sekvencēšana ar ķēdes gala inhibitoriem. Valsts zinātņu akadēmijas darbi, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S. C. (2007). Nākamās paaudzes sekvencēšana pārveido mūsdienu bioloģiju. Dabas metodes, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (Ed.). (2014). Nākamās paaudzes secība. Caister Academic Press.