Baktēriju uztriepes īpašības un sagatavošana



The baktēriju uztriepes ir baktēriju mikroorganismu suspensijas plāna plēve, kas tiek veikta uz caurspīdīgas stikla plāksnes vai priekšmetstikliņiem novērošanai ar optisko mikroskopu..

Paplašinājums plēves veidā tiek veikts, lai pēc iespējas atdalītu mikroorganismus, jo, ja tie ir grupēti, novērojums nav skaidrs..

Pētot baktēriju kultūras, tiek analizētas uztriepes sagatavošanas, fiksācijas un krāsošanas metodes, lai tās labāk analizētu. Mikroorganismu nelielā izmēra dēļ tā novērošanai obligāti ir nepieciešams izmantot optisko mikroskopu.

Optiskie mikroskopi ir nepieciešami instrumenti uztriepju novērošanai. Tie izmanto optiskās lēcas un gaismu, kas ļauj vizualizēt paraugus ar lielu izmēra pieaugumu.

Kopumā dzīvajām šūnām nav struktūru, kas ir galvenokārt krāsainas, redzamas caur optisko mikroskopu, tās ir bezkrāsainas, caurspīdīgi paraugi un uzrāda ļoti mazu iekšējo kontrastu un apkārtējo vidi..

Novērošana ar vienkāršu gaismas lauka mikroskopu, neizmantojot papildu krāsošanas paņēmienus, ir ļoti ierobežota un to izmanto tikai dažos gadījumos, piemēram, novērojot mikroorganismu kustību..

Lai optimāli novērotu mikroorganismus, jāsasniedz līdzsvars starp kontrastu un izšķirtspēju. Šūnu detaļas nevar novērot mikroskopā, pat ar augstu izšķirtspēju; krāsvielu izmantošana ir nepieciešama, izmantojot krāsošanas metodes, kas nodrošina kontrastu novērošanai.

Indekss

  • 1 Labas kvalitātes baktēriju uztriepes
    • 1.1 Lielisks kontrasts
    • 1.2 Labs labojums
    • 1.3. Laba krāsošana
  • 2 Sagatavošana
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Fiksācija
    • 2.3 C. Vienkārša krāsošana
    • 2.4. Smērvielas galīgā saglabāšana
  • 3 Atsauces

Labas kvalitātes baktēriju uztriepes

Lielisks kontrasts

Lai panāktu lielisku kontrastu, tiek izsaukti sarežģīti mikroskopi fāzes kontrasta mikroskopu, diferenciālo traucējumu un tumšā lauka mikroskopu. Šāda veida mikroskopu izmanto, lai cita starpā novērotu baktēriju struktūras, piemēram, apvalkus un pavedienus.

Krāsošana ir vienkārša tehnika, lai palielinātu kontrastu, kas tiek panākts ar skaidru lauka mikroskopu. Šajā metodē var izmantot dažādas krāsvielas, kas ievērojami uzlabo novērošanu zem mikroskopa.

Traipi tiek izgatavoti tieši uz mikroorganismu suspensijām, kas iepriekš izžāvētas un nostiprinātas..

Labs labojums

Fiksācija ir tehnika, ko izmanto šūnu struktūru saglabāšanai; izraisa mikroorganismu inaktivāciju un saķeri ar glāzi. Pastāv dažādas fiksācijas procedūras: siltuma fiksācija un ķīmiskā fiksācija.

Siltuma fiksācija

Šī ir metode, ko visbiežāk izmanto baktēriju uztriepes novērošanai. Šī metode sastāv no uztriepes baktēriju suspensijas nodošanas ar šķiltavas liesmu. Šī metode spēj saglabāt baktēriju ārējo morfoloģiju, bet iznīcina to iekšējās struktūras.

Ķīmiskā fiksācija

Ķīmiskā fiksācija izmanto ķīmiskās vielas, piemēram, formaldehīdu vai formaldehīdu, etanolu un etiķskābi. Ķīmisko stiprinājumu izmantošanas priekšrocība ir tā, ka tiek panākta mikroorganismu iekšējo šūnu struktūru saglabāšana.

Laba krāsošana

Visbiežāk iepriekš žāvētas un fiksētas uztriepes krāsošanas metodes ir pozitīva vai vienkārša krāsošana, diferenciāla krāsošana un negatīva krāsošana. Ir arī īpašas metodes konkrētu šūnu struktūru krāsošanai (kapsula, sporas, flagella)..

Pozitīva krāsošana vai vienkārša iekrāsošana

Pozitīvākā vai vienkāršākā iekrāsošana ir visbiežāk izmantotā traipu smērēšanas tehnika. Izmanto krāsvielas, kas spēj saistīties ar noteiktām mikrobu struktūrām, ļaujot tās novērot mikroskopā.

Šīm krāsvielām ir hromoforiskas grupas (krāsaina daļa) to ķīmiskajā struktūrā, ar mainīgām divkāršām saitēm un vienkāršām saitēm (konjugācija). Šīs saites var radīt jonu vai kovalentās saites ar dažām šūnu struktūrām.

Krāsvielas, kas tiek izmantotas pozitīvā vai vienkāršā krāsošanā, galvenokārt ir ķīmiskie atvasinājumi anilīns (krāsaini organiskie sāļi).

No otras puses, starp krāsvielām var atrast dažus ar bāzes pH un citiem ar skābes pH.

Pamatvielas

Pamatkrāsās hromoforu grupai ir pozitīva elektriskā lādiņa. Lielākajai daļai prokariotu mikroorganismu ir neitrāls iekšējais pH, un to šūnu virsma ir negatīvi uzlādēta. Ar šo elektrostatisko mijiedarbību hromofors saistās ar šūnu un krāso to.

Bāzes krāsvielu piemēri ir metilēnzilā, violeta kristāla, malahīta zaļa, pamata fuscin, safranīns, cita starpā.

Skābes krāsvielas

Skābās krāsās hromoforu grupai ir negatīva elektriskā lādiņa. Tie tiek izmantoti proteīnu krāsošanai ar pozitīvi uzlādētām amino grupām. Skābes krāsvielu piemēri ir skābes fuscīns, rožu Bengālija, Kongo sarkans un eozīns.

Diferenciāla krāsošana

Diferenciālās krāsošanas paņēmiens sastāv no divu dažādu krāsu vai intensitātes krāsvielu pielietošanas, lai atšķirtu dažādus mikroorganismus mikroskopā. Gramu traipi un rezistence pret skābi un alkoholu ir visbiežāk izmantotie difūzijas traipi bakterioloģijā.

Grama traipu izmanto kā sākotnējo testu, lai uzzinātu papildus šūnu sienas veidam, lielumam, šūnu grupēšanai. Ar Gram traipu testu baktērijas ar šūnu sienām tiek klasificētas kā grampozitīvas baktērijas un gramnegatīvas baktērijas.

Negatīva krāsošana

Šajā metodē tiek izmantotas ķīmiskās krāsvielas, kas neietekmē šūnu interjeru, bet tās dara, ka vide, kurā mikroorganismi parādās kā melns fons.

Negatīvās krāsošanas paņēmienā uztriepes tiek izgatavotas ar Ķīnas tintes vai nigrosīna suspensijas pilienu, kas pēc tam, kad ir atļauts žāvēt istabas temperatūrā, veido gaismas caurspīdīgu filmu. Šādā veidā mikroorganismi tiek uzskatīti par spilgtiem veidiem tumšā fonā.

Sagatavošana

A. Smērēšana

1.- Noskalojiet slaidus ļoti labi, nosusiniet ar absorbējošu papīru un marķējiet tos. Marķējumā jānorāda preparāta saturs, datums un tās personas vārds, kura to apstrādājusi.

2.- Apgaismojiet vieglāku un sterilizējiet inokulācijas cilpu liesmā, līdz tas kļūst sarkans.

3.- Ļaujiet rokturim atdzist.

4.- Paņemiet baktēriju kultūras cauruli, noņemiet vāciņu un ātri izskalojiet caurules muti pie šķiltavas liesmas (liesma).

5.- Ieviest inokulācijas cilpu caurulē, kurā ir baktēriju kultūra, un ņem paraugu.

6.- Ja kultūra ir šķidrā vidē, paraugu ņem ar rokturi slaida centrā un uzmanīgi izkaisiet to apli, kura diametrs ir aptuveni 2 cm..

7.- Inokulācijas cilpas sterilizēšana.

8.- Ļaut žāvēt uztriepes gaisā.

9.- Atkārtojiet 3. līdz 8. soli trīs reizes.

10.- Ja kultūra ir cietā vidē, uz slaida iepriekš jānovieto destilēta ūdens piliens. Tas tiek darīts, lai sajauktu nelielu parauga paraugu, kas ņemts ar inokulācijas rokturi, saskaņā ar 2. līdz 5. posma norādījumiem (aseptikas apstākļi)..

11.- Pagariniet atšķaidīto paraugu ar ūdens pilienu uz slaida un atkārtojiet trīs reizes.

B. Fiksācija

1.- Pievieno sausajām smērvielām, kas ražotas no kultūru šķidrā vidē - divi pilieni metanola vai absolūtā etanola.

2.- Ļaujiet žāvēt gaisā no šķiltavas.

3.- Ja smērviela nāk no kultūras cietā vidē, sausa uztriepes tiek fiksētas ar karstumu, izlaižot to 2 līdz 3 reizes ātrāk caur šķiltavas karstākās vietas..

4.- Pieskarieties apmatojuma apakšējai daļai ar kreisās puses muguras daļu (ar labo roku, citādi izmantojiet labo roku) un pārbaudiet, vai tas ir auksts.

C. Vienkārša krāsošana

1.- Pievienojiet 2 pilienus atlasītās krāsvielas un ļaujiet tai iedarboties uz laiku, kāds nepieciešams katras krāsas īpašajos protokolos (parasti no 1 līdz 5 minūtēm).

2.- Dažām krāsvielām ir nepieciešama siltuma izmantošana to aktivizēšanai, tādā gadījumā ir nepieciešams ļoti uzmanīgi sildīt slaidu šķiltavas liesmā (manipulēt ar pinceti un izvairīties no viršanas). Emisijas pārkaršana var iznīcināt šūnas, kuras vēlaties novērot.

3.- Noņemiet lieko krāsu, mazgājot ar destilētu ūdeni no piketes. Noņemiet mazgāšanas ūdeni, viegli pieskaroties slaidam uz tās malas, noliecot uz darba galda.

4.- Ļaujiet žāvēt gaisu.

5.- Atkarībā no novērošanas veida šajā posmā tiek izmantots pārsegs. Pārklājums aizsargā un saglabā uztriepes. Ja novērošana tiek veikta, iegremdējot eļļā šajā posmā, netiek izmantots pārsegs, bet uztriepes nevar saglabāt.

D. Smērvielas galīgā saglabāšana

1.- Iemērciet uztriepes secīgi katrā no turpmāk norādītajiem šķīdumiem vismaz 5 minūtes. Šo "vannu" mērķis ir atstāt uztriepes pilnībā dehidratētu. Katrs reaģents ir jāiztukšo, pirms uzlikt uztriepi nākamajā vannā.

Dehidratējošo vannu secība ir šāda:

  1. Etanols 70%
  2. 95% etanola
  3. Tīrs acetons
  4. Sajauc acetona-ksilolu 1: 1
  5. Xilol

Tad ļaujiet žāvēt gaisu.

2.- Uzlieciet pārsegu, vēlams 22 × 22 mm, izmantojot Kanādas balzamu vai citus montāžas līdzekļus.

Atsauces

  1. Briggs, G. (1965). Cēloņsakarības mikrobioloģisko laboratoriju negadījumos un infekcijās. ASV armijas bioloģiskās laboratorijas. Detriksas cietoksnis.
  2. Cappucino, J.G. un Welch, C.T. (2017). Mikrobioloģija: laboratorijas rokasgrāmata. Pearson.
  3. Holt, J.G. Redaktors (1977). Īsāks Bergejas vadlīnijas par noteicošo bakterioloģiju. 8th Baltimore: The Williams un Wilkins Co.
  4. Johnson, T.R. un Lieta; C.L. (2018). Laboratorijas eksperimenti mikrobioloģijā. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Diagnostiskā mikrobioloģija. 14th Sentluisa, ASV: Elsiever, Inc.