Ierobežošanas enzīmu funkcijas, darbības mehānisms, veidi un piemēri



The restrikcijas enzīmus tie ir endonuklāzes, ko izmanto dažas arhīvi un baktērijas, lai kavētu vai "ierobežotu" vīrusu izplatību tajās. Tie ir īpaši izplatīti baktērijās un ir daļa no to aizsardzības sistēmas pret ārzemju DNS, kas pazīstama kā ierobežošanas / modifikācijas sistēma.

Šie fermenti katalizē divrindu DNS griešanu noteiktās vietās, reproducējami un bez papildu enerģijas izmantošanas. Lielākā daļa pieprasa kofaktoru, piemēram, magnija vai citu divvērtīgu katjonu, klātbūtni, lai gan dažiem ir nepieciešama ATP vai S-adenozilmetionīns..

Ierobežojumu endonukleazes 1978. gadā atklāja Daniels Nathans, Arber Werner un Hamilton Smith, kas saņēma Nobela prēmiju medicīnai par atklāšanu. Tās nosaukums parasti izriet no organisma, kurā tie pirmo reizi novēroti.

Šādi fermenti tiek plaši izmantoti DNS klonēšanas metožu un citu molekulārās bioloģijas un gēnu inženierijas stratēģiju izstrādē. Tā īpašo secību atpazīšanas īpašības un spēja samazināt sekvences tuvu atpazīšanas vietām padara tos par spēcīgiem instrumentiem ģenētiskajā eksperimentēšanā.

Fragmentus, ko ģenerē restrikcijas fermenti, kas ir ietekmējuši kādu konkrētu DNS molekulu, var izmantot, lai no jauna izveidotu sākotnējās molekulas "karti", izmantojot informāciju par vietām, kur enzīms sagriež DNS..

Dažiem restrikcijas fermentiem var būt tāda pati atpazīšanas vieta DNS, bet tie ne vienmēr sagriež to tādā pašā veidā. Līdz ar to ir fermenti, kas padara izcirtņus atstājot asus galus un fermentus, kas sagriež izejošus vienādus galus, kuriem ir atšķirīgi pielietojumi molekulārajā bioloģijā..

Šobrīd ir simtiem dažādu komerciāli pieejamu ierobežošanas enzīmu, ko piedāvā dažādas tirdzniecības mājas; šie fermenti darbojas kā "pielāgotas" molekulārās šķēres dažādiem mērķiem.

Indekss

  • 1 Funkcijas
  • 2 Darbības mehānisms
  • 3 veidi
    • 3.1. I tipa restrikcijas fermenti
    • 3.2. II tipa restrikcijas fermenti
    • 3.3 III tipa restrikcijas fermenti
    • 3.4. IV tipa restrikcijas fermenti
    • 3.5. V tipa restrikcijas fermenti
  • 4 Piemēri
  • 5 Atsauces

Funkcijas

Restrikcijas fermenti kalpo polimerāžu pretējai funkcijai, jo tie hidrolizē vai salauž estera saiti fosfodiestera saitē starp blakus esošajiem nukleotīdiem nukleotīdu ķēdē.

Molekulārās bioloģijas un ģenētiskās inženierijas jomā tie tiek plaši izmantoti ekspresijas un klonēšanas vektoru konstruēšanai, kā arī specifisku sekvences noteikšanai. Tās ir arī noderīgas rekombinanto genomu veidošanai un tām ir liels biotehnoloģiskais potenciāls.

Nesenie gēnu terapijas sasniegumi padara pašreizējo restrikcijas fermentu izmantošanu noteiktu gēnu ievešanai vektoros, kas ir transportlīdzekļi šādu gēnu transportēšanai uz dzīvajām šūnām, un kas, iespējams, spēj ievietot šūnu genomā, lai veiktu pastāvīgas izmaiņas.

Darbības mehānisms

Restrikcijas fermenti var katalīt divkāršās DNS griešanu, lai gan daži spēj atpazīt viendzīslas DNS sekvences un pat RNS. Izgriešana notiek pēc secību atpazīšanas.

Darbības mehānisms ir fosfodiestera saiknes hidrolīze starp fosfātu grupu un deoksiribozi katras DNS virknes mugurkaulā. Daudzi no fermentiem spēj sagriezties tajā pašā vietā, ko viņi atpazīst, bet citi - 5 vai 9 pāru bāzes pirms vai pēc tā..

Parasti šie fermenti sagriež fosfātu grupas 5'-galā, radot DNS fragmentus ar 5'-fosforila galu un 3'-termināla hidroksila galu.

Tā kā olbaltumvielas nenonāk tiešā saskarē ar atpazīšanas vietu DNS, tās ir jātransponē secīgi, līdz tās sasniedz konkrēto vietu, iespējams, izmantojot "slīdošos" mehānismus uz DNS..

Enzīmu griezuma laikā katras DNS virknes fosfodiesteru saite atrodas vienā no restrikcijas fermentu aktīvajām vietām. Kad enzīms atstāj atpazīšanas un griešanas vietu, tas notiek ar nespecifiskām pārejas asociācijām.

Veidi

Pašlaik ir zināmi pieci restrikcijas fermentu veidi. Tālāk sniegts īss katra apraksta apraksts:

I tipa restrikcijas fermenti

Šie fermenti ir lieli pentameriskie proteīni ar trim apakšvienībām, ierobežojums, metilēšana un cits DNS sekvences atpazīšanai. Šīs endonuklāzes ir daudzfunkcionālas olbaltumvielas, kas spēj katalizēt restrikcijas un modifikācijas reakcijas, tām ir ATPāzes aktivitāte un arī DNS topoizomerāze..

Šāda veida fermenti bija pirmie endonuklāzes, kas tika atklāti, tie pirmo reizi tika attīrīti 1960. gados un kopš tā laika tie ir pētīti ar lielu dziļumu.

I tipa fermenti netiek plaši izmantoti kā biotehnoloģisks līdzeklis, jo griešanas vieta var būt dažādos attālumos līdz 1000 bāzes pāriem no atpazīšanas vietas, kas padara tos neuzticamus eksperimentālās reproducējamības ziņā..

II tipa restrikcijas fermenti

Tie ir fermenti, kas sastāv no homodimēriem vai tetramēriem, kas DNS samazina noteiktās vietās no 4 līdz 8 bp garuma. Šīs griešanas vietas parasti ir palindromiskas, tas ir, tās atpazīst sekvences, kas abos virzienos tiek nolasītas vienādi.

Daudzi no II tipa restrikcijas enzīmiem baktērijās pazemina DNS, kad viņi atpazīst savu ārējo raksturu, jo tiem nav raksturīgo modifikāciju, kas būtu jāveic DNS..

Tie ir vienkāršākie restrikcijas fermenti, jo tiem nav nepieciešami nekādi citi kofaktori, izņemot magniju (Mg +), lai atpazītu un sagrieztu DNS sekvences..

II tipa restrikcijas fermentu precizitāte, atpazīstot un sagriežot vienkāršas sekvences DNS precīzās pozīcijās, padara tos par vienu no visvairāk lietotajiem un neaizstājamajiem lielākajā daļā molekulārās bioloģijas nozaru..

II tipa restrikcijas enzīmu grupā ir vairākas apakšklases, kas klasificētas atbilstoši atsevišķām īpašībām, kas ir unikālas katrai no tām. Šo fermentu klasifikācija tiek veikta, pievienojot alfabēta burtus no A līdz Z pēc fermenta nosaukuma.

Dažas no apakšklasēm, kas pazīstamas ar to lietderību, ir šādas:

IIA apakšklase

Tie ir dažādu apakšvienību dimeri. Viņi atpazīst asimetriskas sekvences un izmanto kā ideālus prekursorus griešanas fermentu ģenerēšanai.

IIB apakškategorija

Tie sastāv no vēl viena dimera un sagriež DNS abās atpazīšanas secības pusēs. Viņi sagriež abas DNS virknes virknē bāzes pāri ārpus atpazīšanas vietas.

IIC apakšklase

Šāda veida fermenti ir polipeptīdi ar funkcijām sadalīt DNS modifikācijas un modificēt tās. Šie fermenti asimetriski sagriež abus virzienus.

IIE apakškategorija

Šīs apakšklases fermenti ir visizplatītākie ģenētiskajā inženierijā. Tiem ir katalītiska vieta un parasti tiem ir nepieciešams allosterisks efektors. Šiem enzīmiem jādarbojas ar divām to atpazīšanas secību kopijām, lai veiktu efektīvu griezumu. Šajā apakšklasē ir EcoRII un EcoRI enzīmi.

III tipa restrikcijas fermenti

III tipa restrikcijas endonuklāzes sastāv tikai no divām apakšvienībām, no kurām viena ir atbildīga par DNS atpazīšanu un modifikāciju, bet otra ir atbildīga par secības griešanu.

Šiem fermentiem ir nepieciešami divi kofaktori to darbībai: ATP un magnija. Šāda veida restrikcijas enzīmiem ir divas asimetriskas atpazīšanas vietas, pārvēršot DNS ATP atkarīgā veidā un sagriežot to no 20 līdz 30 bp blakus atpazīšanas vietai..

IV tipa restrikcijas fermenti

IV tipa fermentus ir viegli identificēt, jo tie sagriež DNS ar metilēšanas tagiem, tie sastāv no vairākām dažādām apakšvienībām, kas ir atbildīgas par DNS sekvences atpazīšanu un griešanu. Šie fermenti izmanto kā kofaktorus GTP un divvērtīgu magniju.

Īpašas griešanas vietas ir nukleotīdu ķēdes ar metilētā vai hidroksimetilētā citozīna atliekām vienā vai abās nukleīnskābju daļās..

V tipa restrikcijas fermenti

Šī klasifikācija ietver CRISPER-Cas tipa enzīmus, kas identificē un sagriež specifiskas DNS sekvences no invāzijas organismiem. Cas enzīmi izmanto CRISPER sintezētās vadošās RNS virkni, lai atpazītu un uzbruktu invāzijas organismiem.

Enzīmi, kas klasificēti kā V tips, ir polipeptīdi, kas strukturēti pēc I, II un II tipa enzīmiem. Viņi var griezt gandrīz jebkura organisma DNS fragmentus ar lielu garuma diapazonu. To elastīgums un lietošanas ērtums mūsdienās padara šos fermentus par vienu no visbiežāk izmantotajiem gēnu inženierijas instrumentiem kopā ar II tipa enzīmiem..

Piemēri

DNS polimorfismu noteikšanai tika izmantoti restrikcijas enzīmi, īpaši populācijas ģenētikas pētījumos un evolucionārajos pētījumos, izmantojot mitohondriju DNS, lai iegūtu informāciju par nukleotīdu aizvietošanas ātrumu..

Pašlaik vektoriem, ko izmanto baktēriju transformācijai ar dažādiem mērķiem, ir multikonache vietas, kur ir atrodamas vairāku restrikcijas enzīmu atpazīšanas vietas..

No šiem fermentiem populārākie ir EcoRI, II, III, IV un V, kas iegūti un aprakstīti pirmo reizi E. coli; HindIII, no H. influenzae un BamHI B. amyloliquefaciens.

Atsauces

  1. Bickle, T. A., un Kruger, D. H. (1993). DNS ierobežošanas bioloģija. Mikrobioloģiskie pārskati, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., un Horvath, P. (2007). CRISPR nodrošina iegūto pretestību prokariotu vīrusiem. Zinātne, 315(Marts), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Molekulārā perspektīva: restrikcijas endonuklāzes. Cilmes šūnu vēža medicīnas pamati, 20, 190-191.
  4. Halforda, S.E. (2001). Hopping, lekt un cilpošana ar restrikcijas enzīmiem. Biochemiskās sabiedrības darījumi, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Sugu identitātes saglabāšana un baktēriju spekulācijas kontrole: jauna funkcija ierobežošanas / pārveidošanas sistēmām? Gēns, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewin's Genes XII (12 red.). Burlingtona, Masačūsetsa: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Viņa, Q. (2015). I un III tipa CRISPR-Cas sistēmu lietošana genoma rediģēšanai. Nukleīnskābes izpēte, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E.A. & Wilson, G.G. (2013). I tipa restrikcijas fermenti un to radinieki. Nukleīnskābes izpēte, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Endonukleažu restrikcija DNS molekulu analīzē un pārstrukturēšanā. Annu. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., un Tajima, F. (1981). Dna polimorfisms, ko var noteikt ar restrikcijas endonukleazēm. Ģenētika, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., un Wende, W. (2005). Šūnu un molekulārās dzīves zinātnes II tipa restrikcijas endonuklāzes: struktūra un mehānisms. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Kā restrikcijas fermenti kļuva par molekulārās bioloģijas darba zirgiem. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J., un Murray, K. (1976). Ierobežošanas endonuklāzes. Kritiskie pārskati bioķīmijā, (Novembris), 123-164.
  14.  Stoddards, B. L. (2005). Strādājošā endonuklāzes struktūra un funkcija. Ceturkšņa pārskati par biofiziku, 1-47.
  15.  Tock, M. R., un Dryden, D. T. F. (2005). Ierobežojuma un ierobežošanas bioloģija. Pašreizējais atzinums mikrobioloģijā, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., un Murray, N. E. (1991). Ierobežošanas un pārveidošanas sistēmas. Annu. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomiskās ieskats Campylobacter jejuni virulenci un populācijas ģenētiku. Inficēt Dis. Tulkojums. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Daudzfunkcionālo ierobežojumu endonukleažu struktūra un mehānisms. Annu. Biochem., 50, 285-315.