Prokariotisko šūnu īpašības, šūnu struktūra, veidi
The prokariotiskās šūnas tās ir vienkāršas struktūras un bez kodola, ko norobežo plazmas membrāna. Ar šo šūnu tipu saistītie organismi ir vienšūnas, lai gan tos var grupēt un veidot sekundāras struktūras, piemēram, ķēdes.
No trijām Carl Woese piedāvātajām dzīves jomām prokariotes atbilst baktērijām un arhīvam. Atlikušais domēns Eucarya sastāv no lielākām, sarežģītākām un ar norobežotu kodolu eukariotiskām šūnām.
Viena no svarīgākajām bioloģiskās zinātnes dichotomijām ir atšķirība starp eukariotisko šūnu un prokariotisko šūnu. Vēsturiski prokariotisko organismu uzskata par vienkāršu, bez iekšējās organizācijas, bez organellām un bez citozkeleta. Tomēr jauni pierādījumi iznīcina šīs paradigmas.
Piemēram, prokariotēs ir identificētas struktūras, kuras var uzskatīt par organellām. Tāpat ir atrastas olbaltumvielas, kas ir homoloģiskas ar eukariotu proteīniem, kas veido citoskeletu.
Prokarioti ir ļoti dažādi. Viņi var izmantot saules gaismu un enerģiju, kas atrodas ķīmiskajās saitēs kā enerģijas avotu. Tās var izmantot arī dažādus oglekļa avotus, piemēram, oglekļa dioksīdu, glikozi, aminoskābes, olbaltumvielas..
Prokariotes tiek sadalītas aseksuāli ar bināro šķelšanos. Šajā procesā organisms atkārto savu cirkulāro DNS, palielina tā tilpumu un beidzot to sadala divās identiskās šūnās.
Tomēr pastāv mehānismi ģenētiskā materiāla apmaiņai, kas rada baktēriju mainīgumu, piemēram, transdukciju, konjugāciju un transformāciju..
Indekss
- 1 Vispārīgi raksturlielumi
- 2 Struktūra
- 3 Prokariotu veidi
- 4 Prokariotu morfoloģija
- 5 Pavairošana
- 5.1. Seksuāla reprodukcija
- 5.2. Papildu ģenētiskās variācijas avoti
- 6 Uzturs
- 6.1. Uzturīgas kategorijas
- 6.2. Fotoautotrofi
- 6.3. Fotoheterotrofi
- 6.4. Chemoautotrofi
- 6.5 Chemoheterotrofi
- 7 Metabolisms
- 8 Būtiskas atšķirības ar eukariotu šūnām
- 8.1. Izmērs un sarežģītība
- 8.2
- 8.3 Ģenētiskā materiāla organizēšana
- 8.4 Ģenētiskā materiāla blīvēšana
- 8.5 Organelles
- 8.6. Ribosomas struktūra
- 8.7 Šūnu siena
- 8.8 Šūnu dalīšana
- 9 Filoģenētika un klasifikācija
- 10 Jaunas perspektīvas
- 10.1. Organiskie produkti prokariotos
- 10.2. Magnetosomi
- 10.3 Fotosintētiskās membrānas
- 10.4 Planktomicetes nodalījumi
- 10.5. Cytoskeleta sastāvdaļas
- 11 Atsauces
Vispārīgās īpašības
Prokarioti ir salīdzinoši vienkārši vienšūnas organismi. Izcilākais raksturojums, kas identificē šo grupu, ir patiesa kodola neesamība. Tie ir sadalīti divās lielās nozarēs: patiesās baktērijas vai eubaktērijas un arhebaktērijas.
Viņi ir kolonizējuši gandrīz visu iespējamo biotopu, no ūdens un augsnes līdz citu organismu, tostarp cilvēka, interjeram. Konkrētāk, arhebaktērijas apdzīvo teritorijas ar temperatūru, sāļumu un ekstremālu pH līmeni.
Struktūra
Tipiska prokariota arhitektūras shēma neapšaubāmi ir tā, ka Escherichia coli, baktērija, kas parasti dzīvo mūsu kuņģa-zarnu traktā.
Šūnu forma ir līdzīga cukurniedrēm, un tās diametrs ir 1 um un garums ir 2 um. Prokariotes ieskauj šūnu siena, kas sastāv galvenokārt no polisaharīdiem un peptīdiem.
Baktēriju šūnu siena ir ļoti svarīga īpašība, un saskaņā ar struktūru ļauj izveidot klasifikācijas sistēmu divās lielās grupās: gram-pozitīvās un gramnegatīvās baktērijas.
Sekojot šūnu sienai, mēs atrodam lipīdu dabisko membrānu (kopīgu elementu starp prokariotiem un eukariotēm) ar tajā iekļautiem protēžu elementiem, kas atdala organismu no tās vides..
DNS ir apļveida molekula, kas atrodas noteiktā reģionā, kuram nav nekādas membrānas vai atdalīšanas ar citoplazmu..
Citoplazmam piemīt raupja izskats un tam ir aptuveni 3000 ribosomu - struktūras, kas atbild par proteīnu sintēzi.
Prokariotu veidi
Pašreizējās prokariotes veido dažādas baktērijas, kas ir sadalītas divās galvenajās jomās: Eubacteria un Archaebacteria. Saskaņā ar pierādījumiem šīs grupas šķiet ļoti atšķirīgas evolūcijas sākumā.
Arhebaktērijas ir prokariotu grupa, kas parasti dzīvo vidē, kuras apstākļi ir neparasti, piemēram, temperatūra vai augsts sāļums. Šie apstākļi mūsdienās ir reti, bet tie var būt primitīvajā zemē.
Piemēram, termoacidofīli dzīvo vietās, kur temperatūra sasniedz maksimumu 80 ° C un pH ir 2.
No otras puses, eubaktērijas dzīvo mums kopīgā vidē. Viņi var apdzīvot augsni, ūdeni vai dzīvot citos organismos, piemēram, baktērijās, kas ir daļa no mūsu gremošanas trakta.
Prokariotu morfoloģija
Baktērijas nonāk virknē ļoti daudzveidīgu un neviendabīgu morfoloģiju. Visbiežāk mums ir noapaļotie, ko sauc par kokosriekstiem. Tos var uzrādīt individuāli, pāros, ķēdē, tetrados utt..
Dažas baktērijas ir morfoloģiski līdzīgas cukurniedrēm, un tās sauc par bacillām. Tāpat kā kokosriekstus var atrast atšķirīgā kārtībā ar vairāk nekā vienu indivīdu. Mēs atrodam arī spirālveida spirocetus un tos, kuriem ir koma vai graudu forma, sauc par vibrios.
Katra no šīm aprakstītajām morfoloģijām var atšķirties dažādās sugās - piemēram, viens bacillus var būt garāks par citu vai ar vairāk noapaļotām malām - un ir noderīgs, nosakot sugu..
Pavairošana
Aeksuāla reprodukcija
Reprodukcija baktērijās ir aseksuāla un notiek, izmantojot bināro sadalīšanos. Šajā procesā organisms burtiski "saplīst divos", kā rezultātā rodas sākotnējā organisma kloni. Lai tas notiktu, ir jābūt pietiekamiem resursiem.
Process ir salīdzinoši vienkāršs: cirkulārie DNS replikāti, veidojot divus identiskus dubultos helikātus. Pēc tam ģenētiskais materiāls tiek ievietots šūnu membrānā, un šūna sāk augt, līdz tā dubultojas. Šūna beidzot ir sadalīta, un katrai iegūtajai daļai ir cirkulāra DNS kopija.
Dažās baktērijās šūnas var sadalīt materiālu un augt, bet tās vispār nesadalās un veido sava veida ķēdi.
Papildu ģenētiskās variācijas avoti
Pastāv gēnu apmaiņas notikumi starp baktērijām, kas pieļauj ģenētisko pārnesi un rekombināciju, kas ir līdzīgs tam, ko mēs pazīstam kā seksuālo reprodukciju. Šie mehānismi ir konjugācija, transformācija un transdukcija.
Konjugācija sastāv no ģenētiskā materiāla apmaiņas starp divām baktērijām, izmantojot struktūru, kas ir līdzīga smalkiem matiņiem, ko sauc par pili vai fimbrias, kas darbojas kā "tilts". Šajā gadījumā ir jābūt fiziskai tuvībai starp abiem indivīdiem.
Pārveidošana ietver kailā DNS fragmentu atrašanu vidē. Tas nozīmē, ka šajā procesā otrā organisma klātbūtne nav nepieciešama.
Visbeidzot, mums ir tulkojums, kur baktērija iegūst ģenētisko materiālu, izmantojot vektoru, piemēram, bakteriofāgi (vīrusi, kas inficē baktērijas).
Uzturs
Baktērijām ir vajadzīgas vielas, kas garantē to izdzīvošanu un nodrošina tām nepieciešamo enerģiju šūnu procesiem. Šūnā šīs barības vielas tiks absorbētas.
Kopumā mēs varam klasificēt uzturvielas kā būtiskas vai pamata (ūdens, oglekļa avoti un slāpekļa savienojumi), sekundāras (kā daži joni: kālijs un magnija) un mikroelementi, kas nepieciešami minimālajās koncentrācijās (dzelzs, kobalta).
Dažām baktērijām ir vajadzīgi specifiski augšanas faktori, piemēram, vitamīni un aminoskābes, un stimulējošie faktori, kas, lai gan nav būtiski, palīdz augšanas procesā..
Baktēriju uztura prasības ir ļoti atšķirīgas, taču to zināšanas ir nepieciešamas, lai varētu sagatavot efektīvas kultūras barotnes, kas nodrošina interesējoša organisma augšanu..
Uztura kategorijas
Baktērijas var klasificēt atkarībā no oglekļa avota, ko tās izmanto, organiskā vai neorganiskā veidā un atkarībā no iegūtā enerģijas avota.
Saskaņā ar oglekļa avotu mums ir divas grupas: autotrofi vai litotrofi izmanto oglekļa dioksīdu un heterotrofus vai organotrofus, kam nepieciešams organiskais oglekļa avots.
Enerģijas avota gadījumā mums ir arī divas kategorijas: fototrofi, kas izmanto enerģiju, kas nāk no saules vai starojuma enerģijas, un chemiotrophs, kas ir atkarīgi no ķīmisko reakciju enerģijas. Tādējādi, apvienojot abas kategorijas, baktērijas var iedalīt:
Fotoautotrofi
Enerģija tiek iegūta no saules gaismas, kas nozīmē, ka tie ir fotosintētiski aktīvi, un to oglekļa avots ir oglekļa dioksīds.
Fotoheterotrofi
Viņi spēj izmantot starojuma enerģiju to attīstībai, bet nespēj iekļaut oglekļa dioksīdu. Tāpēc viņi izmanto citus oglekļa avotus, piemēram, spirtus, taukskābes, organiskās skābes un ogļhidrātus.
Chemoautotrofi
Enerģija tiek iegūta no ķīmiskām reakcijām, un tās spēj iekļaut oglekļa dioksīdu.
Chemoheterotrofi
Viņi izmanto enerģiju, kas nāk no ķīmiskām reakcijām, un ogleklis nāk no organiskiem savienojumiem, piemēram, glikozes, kas ir visbiežāk izmantotā - lipīdi un arī proteīni. Ņemiet vērā, ka enerģijas avots un oglekļa avots abos gadījumos ir vienādi, tāpēc atšķirība starp abiem ir sarežģīta.
Parasti mikroorganismi, kurus uzskata par cilvēka patogēniem, pieder pie šīs pēdējās kategorijas un izmanto kā oglekļa avotu to saimnieku aminoskābes un lipīdu savienojumus..
Metabolisms
Metabolisms ietver visas sarežģītās ķīmiskās reakcijas, ko katalizē fermenti, kas rodas organisma iekšienē, lai tā varētu attīstīties un vairoties.
Baktērijās šīs reakcijas neatšķiras no pamata procesiem, kas notiek sarežģītākos organismos. Patiesībā mums ir vairāki maršruti, kurus kopīgi izmanto abas organismu līnijas, piemēram, glikolīze.
Metabolisma reakcijas tiek iedalītas divās galvenajās grupās: biosintēze vai anaboliskas reakcijas, kā arī noārdīšanās vai kataboliskas reakcijas, kas rodas, lai panāktu ķīmiskās enerģijas ražošanu..
Kataboliskās reakcijas izdalās pa enerģiju, ko organisms izmanto sastāvdaļu biosintēzei.
Būtiskas atšķirības ar eukariotu šūnām
Prokariotes atšķiras no prokariotēm galvenokārt šūnu strukturālajā sarežģītībā un tajā notiekošajos procesos. Tālāk mēs aprakstīsim galvenās atšķirības starp abām līnijām:
Izmērs un sarežģītība
Parasti prokariotiskās šūnas ir mazākas par eukariotēm. Pirmajam ir diametrs no 1 līdz 3 μm, atšķirībā no eukariotiskās šūnas, kas var sasniegt 100 μm. Tomēr ir daži izņēmumi.
Lai gan prokariotiskie organismi ir vienšūnas un mēs nevaram tos novērot ar neapbruņotu aci (ja vien, piemēram, neredzam baktēriju kolonijas), mums nevajadzētu izmantot īpašību, lai nošķirtu abas grupas. Eukariotos mēs atrodam arī vienšūnas organismus.
Faktiski viena no sarežģītākajām šūnām ir vienšūnu eukarioti, jo tajās jāiekļauj visas struktūras, kas nepieciešamas to attīstībai, kas saistīta tikai ar šūnu membrānu. Žanri Paramecijs un Trypanosoma tie ir izcili piemēri.
No otras puses, ir ļoti sarežģīti prokarioti, piemēram, cianobaktērijas (prokariotu grupa, kurā notika fotosintētisko reakciju attīstība)..
Core
Vārds "prokariots" attiecas uz kodola neesamību (pro = iepriekš; karyons = kodols), bet eukariotiem ir patiess kodols (eu = taisnība). Tādējādi šīs divas grupas atdala šī svarīgā organelja klātbūtne.
Prokariātos ģenētiskais materiāls tiek izplatīts konkrētā šūnas rajonā, ko sauc par nukleīdu - un tas nav īsts kodols, jo tas nav saistīts ar lipīdu membrānu..
Eukariotiem ir noteikts kodols un to ieskauj dubultā membrāna. Šī struktūra ir ārkārtīgi sarežģīta, un tā atspoguļo dažādas jomas, piemēram, kodolu. Turklāt šī organelle var mijiedarboties ar šūnas iekšējo vidi, pateicoties kodolpūšu klātbūtnei.
Ģenētiskā materiāla organizēšana
Prokariotes DNS sastāvā ir no 0,6 līdz 5 miljoniem bāzu pāru, un tiek lēsts, ka tās var kodēt līdz pat 5000 dažādiem proteīniem..
Prokariotiskie gēni tiek organizēti vienībās, ko sauc par operoniem - tāpat kā zināmo operona laktozi -, bet eukariotiskie gēni nav.
Gēnos mēs varam atšķirt divus "reģionus": intronus un eksonus. Pirmie ir porcijas, kas neparedz proteīnu un kas traucē kodēt reģionus, ko sauc par eksoniem. Introni ir bieži sastopami eukariotu gēnos, bet ne prokariotos.
Prokarioti parasti ir haploīds (viena ģenētiskā slodze), un eukariotiem ir gan haploīdie, gan poliploīdie slodzi. Piemēram, mēs, cilvēki, esam diploīdi. Tāpat prokariotēm ir vairāk nekā viena hromosoma un eukariotu.
Ģenētiskā materiāla blīvēšana
Šūnu kodolā eukariotiem piemīt sarežģīta DNS organizācija. Garā DNS daļa (aptuveni divi metri) spēj spolēt tādā veidā, ka to var integrēt kodolā un sadalīšanas procesu laikā var vizualizēt mikroskopā hromosomu veidā..
Šis DNS saspiešanas process ietver virkni olbaltumvielu, kas spēj saistīties ar virkni un veidot struktūras, kas atgādina pērļu kaklarotu, kur pavediens tiek attēlots ar DNS un pērlēm. Šīs olbaltumvielas sauc par histoniem.
Histoni evolūcijas laikā ir plaši saglabājušies. Tas nozīmē, ka mūsu histoni ir neticami līdzīgi ar pelēm vai iet tālāk par kukaiņu. Strukturāli tiem piemīt liels skaits pozitīvi lādētu aminoskābju, kas mijiedarbojas ar DNS negatīvajiem lādiņiem.
Prokariātos ir atrasti daži proteīni, kas ir homologi pret histoniem, kas parasti ir pazīstami kā histoni-patīk. Šie proteīni veicina gēnu ekspresijas, DNS rekombinācijas un replikācijas kontroli un, tāpat kā histonus eukariotos, piedalās nukleīnorganizācijās..
Organelles
Eukariotu šūnās var identificēt virkni ļoti sarežģītu subcellulāru nodalījumu, kas veic specifiskas funkcijas.
Nozīmīgākie ir mitohondriji, kas ir atbildīgi par šūnu elpošanas procesiem un ATP veidošanos, un augos izceļas hloroplasts ar triju membrānu sistēmu un nepieciešamajām fotosintēzes iekārtām..
Mums ir arī Golgi kompleksa, gluda un raupja endoplazmatiska retikulija, vakuoli, lizosomi, peroksisomi,.
Ribosomas struktūra
Ribosomas ir mašīnas, kas nepieciešamas proteīnu sintēzei, tāpēc tām jābūt klāt gan eukariotu, gan prokariotu. Lai gan tā ir neaizstājama struktūra abiem, tā lielākoties atšķiras.
Ribosomas sastāv no divām apakšvienībām: viena liela un viena maza. Katru apakšvienību identificē ar parametru, ko sauc par sedimentācijas koeficientu.
Prokariotos lielā apakšvienība ir 50S un mazā apakšvienība ir 30S. Pilnīgu struktūru sauc par 70S. Ribosomas ir izkaisītas citoplazmā, kur tās veic savus uzdevumus.
Eukariotiem ir lielākas ribosomas, lielā apakšvienība ir 60S, mazais ir 40S, un visa ribosoma ir apzīmēta ar vērtību 80S. Tie atrodas galvenokārt enkuros neapstrādātā endoplazmatiskā retikulā.
Šūnu siena
Šūnu siena ir būtisks elements, lai tiktu galā ar osmotisko stresu un kalpo kā aizsargbarjera pret iespējamiem bojājumiem. Gandrīz visām prokariotēm un dažām eukariotu grupām ir šūnu siena. Atšķirība ir tās ķīmiskā rakstura dēļ.
Baktēriju sienu veido peptidoglikāns, polimērs, kas sastāv no diviem strukturāliem elementiem: N-acetil-glikozamīns un N-acetiluramīnskābe, kas savienotas ar β-1,4 tipa saitēm.
Eukariotu līnijā ir arī šūnas ar sienām, galvenokārt dažās sēnēs un visos augos. Sēnīšu sienā visbiežāk sastopamais savienojums ir hitīns un augos tas ir celuloze, daudzu glikozes vienību veidots polimērs..
Šūnu dalīšana
Kā minēts iepriekš, prokariotes tiek sadalītas ar bināro šķelšanos. Eukariotēm ir sarežģīta sadalīšanas sistēma, kas ietver dažādus kodolieroču sadalīšanas posmus, vai tas ir mitoze vai meoze.
Filoloģijas un klasifikācija
Mēs parasti esam pieraduši definēt sugu saskaņā ar E. Mayr ierosinātajiem bioloģiskajiem jēdzieniem 1989. gadā: "krustkrustojošu dabisko populāciju grupas, kas ir reproduktīvi izolētas no citām grupām".
Šī jēdziena piemērošana bezdzimuma sugām, kā tas ir prokariotu gadījumā, nav iespējama. Tāpēc, lai klasificētu šos organismus, ir jābūt citam veidam, kā tuvoties sugas jēdzienam.
Saskaņā ar Rosselló-Mora teikto et al. (2011), phylo-phenetic jēdziens labi iekļaujas šajā līnijā: "monofiliska un genomiski saskaņota atsevišķu organismu kopa, kas uzrāda augstu vispārīgas līdzības pakāpi daudzās neatkarīgās īpašībās, un ir diagnosticējama ar diskriminējošu fenotipisku īpašību".
Agrāk visi prokarioti tika klasificēti vienā "domēnā", līdz Carl Woese ierosināja, ka dzīvības kokam ir trīs galvenās filiāles. Pēc šīs klasifikācijas prokariotes ietver divus domēnus: Archaea un Bacteria.
Baktērijās ir piecas grupas: proteobaktērijas, hlamīdijas, spiroceti cianobaktērijas un grampozitīvās baktērijas. Tāpat mums ir četras galvenās arhīvu grupas: Euryarchaeota, Grupo TACK, Asgard un Grupo DPANN.
Jaunas perspektīvas
Viens no izplatītākajiem jēdzieniem bioloģijā ir prokariotu citozola vienkāršība. Tomēr jauni pierādījumi liecina, ka pastāv potenciāla organizācija prokariotu šūnās. Pašlaik zinātnieki mēģina atdalīt dogmu par to, ka šajā vienšūnu līnijā nav organellu, citoskeleta un citu īpašību..
Organiskie rieksti prokariotos
Šī jaunā un pretrunīgā priekšlikuma autori apliecina, ka eukariotiskajās šūnās ir līmeņu sadalījums, galvenokārt olbaltumvielu robežās un intracelulāros lipīdos..
Saskaņā ar šīs idejas aizstāvjiem, organelle ir nodalījums, ko ieskauj bioloģiska membrāna ar noteiktu bioķīmisko funkciju. Starp šiem "ordeņiem", kas atbilst šai definīcijai, ir arī lipīdu ķermeņi, karboksisomi, gāzes vakuoli, cita starpā..
Magnetosomi
Viens no aizraujošākajiem baktēriju nodalījumiem ir magnetosomas. Šīs struktūras ir saistītas ar noteiktu baktēriju līdzību Magnetospirilums o Magnetococcus - izmantot magnētiskos laukus orientācijai.
Strukturāli tie ir neliels 50 nanometru korpuss, ko ieskauj lipīdu membrāna, kuras interjeru veido magnētiskie minerāli.
Fotosintētiskās membrānas
Turklāt dažās prokariotēs ir "fotosintētiskās membrānas", kas ir visvairāk pētītie šo organismu nodalījumi.
Šīs sistēmas darbojas, lai maksimāli palielinātu fotosintēzes efektivitāti, palielinot pieejamo fotosintētisko proteīnu skaitu un maksimāli palielinot gaismas iedarbībai pakļauto membrānas virsmu..
Nodalījumi Planctomycetes
Nav bijis iespējams izsekot ticamam evolūcijas ceļam no iepriekš minētajiem nodalījumiem uz ļoti sarežģītajām eukariotu organelēm.
Tomēr žanrs Planctomycetes Tā iekšpusē ir virkne nodalījumu, kas pašiem atgādina organellus un var tikt piedāvāti kā eukariotu baktēriju senči. Žanrā Pirellula ir hromosomas un ribosomas, ko ieskauj bioloģiskās membrānas.
Cytoskeleta komponenti
Tāpat ir zināmi olbaltumvielas, kas vēsturiski tika uzskatītas par unikālām eukariotēm, ieskaitot būtiskos šķiedras, kas ir daļa no citoskeleta: tubulīns, aktīns un starpšķiedras.
Nesenie pētījumi ir veiksmīgi identificējuši olbaltumvielas, kas ir homologas tubulīnam (FtsZ, BtuA, BtuB un citi), aktīnam (MreB un Mb1) un starpšķiedrām (CfoA).
Atsauces
- Cooper, G. M. (2000). Šūna: molekulārā pieeja. Sinauer Associates.
- Dorman, C. J., un Deighan, P. (2003). Gēnu ekspresijas regulēšana ar histonu līdzīgiem proteīniem baktērijās. Pašreizējais viedoklis ģenētikā un attīstībā, 13(2), 179-184.
- Guerrero, R., un Berlanga, M. (2007). Prokariotiskās šūnas slēpta puse: mikrobioloģiskās pasaules atklāšana. Starptautiskā mikrobioloģija, 10(3), 157-168.
- Murat, D., Byrne, M., un Komeili, A. (2010). Prokariotisko organelu šūnu bioloģija. Aukstā pavasara ostas perspektīvas bioloģijā, a000422.
- Rosselló-Mora, R., & Amann, R. (2001). Prokariotu sugas jēdziens. FEMS mikrobioloģijas pārskati, 25(1), 39-67.
- Slesarev, A.I., Belova, G.I., Kozyavkin, S.A., & Lake, J.A. (1998). Pierādījumi par histonu H2A un H4 agrīnu prokariotu izcelsmi pirms eukariotu rašanās. Nukleīnskābes izpēte, 26(2), 427-430.
- Souza, W. D. (2012). Prokariotiskās šūnas: citoskeleta un organellu strukturālā organizācija. Atmiņas no Oswaldo Cruz institūta, 107(3), 283-293.